تحاليل الميكروبيولوجي
الجامع لكل تحاليل الميكروبيولوجي .. الجراثيم كائنات دقيقه واسعة الانتشار في البيئة حولنا تعيش في التربة و الماء و المواد العضوية
و تسبب المرض للحيوان و الإنسان و الطيور و النباتات و الحشرات و لها دور كبير في أحداث الأمراض الوبائية التي تصيب الصغار و الكبار و تلوث الغذاء و الهواء و مياه الشرب .
فإنه نظرا لما يتطلبه هذا القسم الذي بدأ المستشفى يعتمد عليه في التشخيص المخبري لدى المريض لذا واجب القيام بعمل هذه النبذة المختصرة بقسم الميكروبيولوجي.
حيث يسعدني أن اقدم لكم هذا الكتاب المرشد للعامل في قسم الميكروبيولوجي.
فهو كتاب منهجي علمي مبسط تم أعداده من قبل أطباء مختصصين في الميكروبيولوجي بحيث يستطيع أن يستوعبه كل من يطلع عليه في سهولة و يسر .
يلزم العمل بقسم الميكروبيولوجي الدقة التامة في الأداء و الحرص على نظافة المعمل قبل و بعد العمل حيث أننا نتعامل مع الجراثيم الحية ، في معظم الأحوال تكون ضارة و معدية مسببة أمراض خطيرة.
التعليمات التالية:
1-أن يكون العمل مرتبا بحيث تكون الأدوات و المحاليل في أماكنها المستخدمة
2-يجب أن تكون الأدوات نظيفة و معقمة تعقيما تاما حتى لا تكون عرضة للتلوث بحالات مرضية.
3-المحافظة على الأحواض و البنش من تلوثها بالصبغات
4-يراعى إلقاء العينات بعد انتهاء العمل منها و الأدوات المستعملة في أماكنها المخصصة
5-عند العمل في العمل في الميكروبيولوجي يراعى أولا لبس القفازات و الكمامة و كذلك توضع ورقة ترشيح أمامك على البنش لكي لا تسقط أي جزء من العينة على البنش فيولوثه
6-توضع العينة و الإبرة في الحامل الخاص بها
7-يراعى نظافة مكان العمل بعد الانتهاء من العمل مباشرة
8-يراعى غسل ألا يدي بالماء و الصابون و المطهر بعد الانتهاء من العمل مباشرة
9- يرعى عدم الأكل و الشرب و التدخين أو وضع ألايدي في الفم و العين أثناء العمل
10- حرق و إعدام المزارع و العينات بعد الانتهاء منها في فرن الحرق
طرق جمع العينات :
لتشخيص الميكروب المسبب للمرض و فصله في حالة نقية يجب اخذ العينة من مكان الإصابة في جسم الإنسان أو الحيوان أو أي سائل محتمل وجود جراثيم مرضية به.
تعليمات مهمة لجمع العينات:
• يستحن أن تؤخذ العينة من المريض قبل بدء العلاج بالمضادات و ذلك لأنها تؤدي إلى عدم نمو الميكروبات على البيئات و بذلك تعطي نتائج غير صحيحة
• تؤخذ عينات البلغم للكشف عن الدرن في الصباح و كذلك عينات البول و تكون من الوسط و هذا هو الأفضل
• عند اخذ مسحات من الحلق يراعى أن يكون الحلق قد مس بأي مطهر أو غرغرة قبل اخذ العينة
• أن تكون العينة المراد زراعتها في كونتينر خاص و معقم
• أن يرفق بالعينة الركوست الخاص بها و مبين فيه الأتي:
1. اسم المريض
2. رقم ملف المريض
3. عمر المريض و جنسه
4. قسم المريض
5. نوع العينة
6. نوع الفحص المطلوب
7. عما إذا كان المريض يأخذ مضادات حيوية و نوعها
8. و كذلك نبذة عن تشخيص المريض
9. اسم الطبيب المعالج و ختمه
• توضع في أوعيه أو حاويات معقمة و جافة و يجب أن تكون محكمة الإغلاق
• تأكد من أن المعلومات مسجلة على العينة
• وضع رقم تسلسلي خاص بقسم الميكروبيولوجي
• التأكد من أن السوائل لا تتسرب من الأنبوب حتى نتفادى الأخطار حتى لا تنتقل العدوى
• التعامل مع العينات في كابينة خاصة حتى لا تؤدي إلى انتشار العدوى
العينات التي يجب رفضها و عدم استقبالها :
1-عينه ليس عليها البيانات الكافية من اسم المريض و التاريخ و نوع العينة و خلافه ...
2-عينة بدون ركوست
3-عينه بها تسرب
4-عينة تأخرت أكثر من 12 ساعة
5-عينه في حاوية غير نظيفة و ليست بالمواصفات المطلوبة
6-عينة بلغم و ليست ببلغم ولكنها لعاب فقط
البيئات culture media :
هي الوسط الصناعي الذي تنمو و تتكاثر عليه البكتريا لأنه يحتوي على المواد الغذائية اللازمة للميكروب و التفاعل الهيدروجيني المناسب له و أيضأ يحتوي على الأكسجين أو ثاني أكسيد الكربون و يحتوي أيضا على الأحماض الأمينيه و الأملاح المعدنية و كل ميكروب ينو و يتكاثر على مستنبت خاص به حيث يحتوي على متطلباته
مثل:
1-Blood Agar
2-Maconkey Agar
3-Chocolate agar
4-Cled Agar
5-Salmonella Shigella Agar (S.S.A).
6-Maconkey Agar. MA.
7-XLD Agar.
ملاحظات هامة عند الزرع
• يلاحظ عند اخذ العينة باللوب التأكد من ملء دائرة اللوب بالعينة و إخراجها من الأنبوبة باحتراس حيث لا تلمس جدار الأنبوبة.
• عند الزرع على الطبق يراعى عدم الضغط على البيئة مما يؤدي إلى تجريح سطح البيئة
• يلاحظ فتح الطبق بمقدار معين و غلقة بعد وضع المزرعة بسرعة حتى لا تتعرض للتلوث
• إبعاد الطبق عن التنفس أثناء الزرع لعدم تلوث الطبق بالبكتيريا الموجودة في زفير الشخص الذي يعمل في المزرعة
• وضع الطبق في الحاضنة بحيث يكون الغطاء للأسفل
• يتم قراءة الأطباق في اليوم التالي و تتم القراءة أولا بعدد المستعمرات (colony count)
ثم تصنف كالأتي :
• إذا لاحظت نمو أكثر من نوعين من المستعمرات على نفس الطبق فان ذلك يعني تلوث و يتوجب طلب عينه أخرى و يتم زرعها
• إذا كان عدد المستعمرات اقل من 10 مستعمرات فإن ذلك يهمل و يعتبر غير ذو قيمة و ليس له أهمية No significant growth
• إذا كان عدد المستعمرات من 10-19 مستعمرة فإنه يعتبر مشكوك فيه و يتم عمل حساسية له و تكتب النتيجة النهائية له.
• إذا كان عدد المستعمرات أكثر من20 فإن ذلك يعتبر نمو حقيقي و يتم عمل اختبارات الحساسية له
عينات البولURINE :
البكتيريا المحتمل وجودها في عينة البول:
• المكورات العنقودية الذهبية staph.aureus
• المكورات السبحية البراز ية
• عصيات الحميات المعوية (التيفود)
• عصيات القولون E.coli ,Strept. faecalis
• عصيات البروتيص
• السيلان
• السل
البيئات المستخدمة في عينات البول:
Blood agar:
بعض أنواع البيئات لا تنمو ألا بوجود الدم مثل:
الالتهاب السحائي الوبائي _الالتهاب الرئوي.
بعض أنواع البكتيريا تفرز خمائر تذيب كرات الدم الحمراء فيمكن التعرف عليها مثل الأنواع المختلفة من المكورات السبحية.
و أهميتها في تمييز نوع التحلل ألفا, بيتا, جاما
Chocolate agar:يستخدم في مزارع الالتهاب الرئوي-السيلان-الأنفلونزا
و أهميتها أيضا في تمييز نمو بكتيريا نيسيريا, هيموفلص
: MacConkeys medium
و هو للتعرف على البكتريا المخمرة لسكر اللاكتوز ( لون احمر أو وردي ) و التي لاتخمرة (نفس لون البيئة) و تنمو فيها عائلة البكتيريا المعوية
: Cled agar
للتفريق بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز و التي لا تخمرة و تحد من نمو بكتيريا البروتيص
طريقة أخذ العينة:
• أن تكون العينة من وسط البول و ذلك حتى لا تحتوي على إفرازات من مجرى البول.
• أن يراعى التنبيه على المريض و خصوصا السيدات بغسل الأعضاء التناسلية الخارجية جيدا بالماء و الصابون.
• يجب أن تفحص العينة خلال 3 ساعات من جمعها حيث أن تكاثر و نمو البكتيريا مما يودي إلى خلل في النتائج الكيميائية مثل نقص الجلوكوز و خلافه.
طريقة الزرع:
1) يتم تسجيل العينة و وضع البيانات في الملف الخاص بالزرع.
2) يتم تسجيل رقم العينة الخاص بالمختبر على الطبق
3) يتم خلط العينة بهدوء لتوزيع أي راسب يكون في قاع العينة.
4) يتم الزرع بأخذ نقطة أو نقطتين من البول و يتم وضعها داخل طبق الزرع
5) يتم توزيع نقطة البول في الطبق باستخدام الإبرة حسب ميكانيكية معينة.
6) توضع الأطباق في الحاضنة عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
عينات البراز :
البكتيريا المحتمل و جودها في عينة البراز:
• السالمونيلا و الشيجيلا
• الكوليرا
• المكورات العنقودية الذهبية staph.aureus
• الإيشريشيا كولاي
• البروتيص
البيئات المستخدمة في على وجه العموم فهي كما يلي:
S.S agar :
تستخدم للعينات البرازية و هي بيئة انتخابية حيث أن هذه البيئة تثبط نمو البكتيريا الموجبة للجرام و كذلك تحتوي
على مثبطات نمو البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز.
فبنسبة للسالونيلا في XLD فلونها زهري و المركز توجد نقطة سوداء
أما في الشيجيلا فلونها زهري و بدون مركز اسود اللون السائد زهري
EMB :
بيئة تفريقية لعزل البكتيريا المعوية السالبة للجرام مثل: سالمونيلا, بروتيص, شيجيلا حيث تحتوي هذه البيئة على دليلين هما Eosine وMethylene blue الذين يفرقان بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز و غير المخمرة
DCA :
تحوي سكر اللاكتوز لذلك تفرق بين المخمرة و غير المخمرة لونها احمر فاتح يقترب من البني في حالة التخمر يتحول لونها إلى الأحمر الباهت.
حيث السالمونيلا لا لون لها و في المركز نقطة سوداء
أما الشيجيلا فهي بدون لون
S.B) Selenite broth
و هي بيئة سائلة غنية لنمو السالمونيلا بأنواعها :
المســحـــات SWABS
البيئات المستخدمة في عينة المسحة:
Blood Agar*
*Sabouraud Agar
Macconkey Agar*
* Chocolate Agar
أما البكتيريا المتوقع نموها فهي كالتالي و ذلك حسب المنطقة المعزولة منها:
1-Beta.Hameolytic Streptococci.
2-Corynebacterium Diphtheriae.
3-Bordetella Pertussis.
4-Meningococci.
5-Staph Aureus.
6-Haemophills Influenzae.
7-Candida albicans.
أنواع المسحات:
1) مسحة من الزور أو الحلق في حالة الدفتيريا – التهاب الزور تزرع على B.A لاحتمال وجود المكورات السبحية المذيبة للدم أو العنقودية الذهبي تزرع على MAC عينات سلبية للجرام
2) مسحة من الجروح و الدمامل و الناسور
3) مسحة من الشرج في الأطفال في حالة الدوسنتريا
4) مسحة من الشرج في حالات الوفاة كما في الكوليرا
5) مسحة من التقيحات التي بالأذن، الأنف، العيون
تزرع على BA لا هوائي و هوائي و أيضا MAC
6) مسحة من الرحم كما في حالة السيلان- حمى النفاس
تزرع على BA+CO2 لاحتمال وجود مكورات سبحية مذيبة للدم
تزرع على MAC لاحتمال وجود العصيات سلبية جرام (بكتيريا القولون)
البيئات المستخدمة في عينة المسحة:
نستعمل Blood Agar و Macconkey Agar فقط
أما في حالة مسحة من الرحم أو العين فنستعمل Blood Agar و Chocolate Agar
التعرف على البكتيريا :
الفحص الميكروسكوبي عن طريق صبغ العينة:
أهمية الصبغة:
1. رؤية البكتيريا و التعرف عليها.
2. بعض أنواع الصبغات تستخدم في التفرقة بين أنواع البكتيريا مثل صبغة جرام التي تفرق بين الإيجابية و السلبية
و صبغة زيل نلسن تصبغ البكتيريا المقاومة للأحماض.
أنواع الصبغات:
**صبغات بسيطة :
• methylene blue stain
• صبغة كاربول فوكسين
**صبغات مركبة :
و هي الصبغات التي تستخدم فيها أكثر من صبغة أولية و منها
• صبغة جرام
و هي تتكون من صبغة الميثيل فيولت Methyl violet و كذلك صبغة اليود Lugol's iodine
• صبغة الزيل نلسن:
تستخدم هذه الصبغة لصبغ البكتيريا المقاومة للأحماض (Acid –Fast) مثل الميكوبكتيريا و ذلك لاحتواء هذه البكتيريا على مواد شمعية لذلك يلزم استخدام مثل هذه الصبغة مع التسخين.
و سوف نتحدث عن صبغة جرام و صبغة الزيل نلسن بشي من التفصيل
صبغة جرام :
• تحضير اللطخة البكتيرية باستخدام محلول ملحي
• غمر الشريحة بمحلول Crystal violet لمدة 30الى 60 ثانية
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي
• غمر الشريحة بمحلول اليود لمدة 30الى 60 ثانية
• غسل الشريحة ثم اغمر في الكحول المطلق لمدة 60 ثانية
• غسل الشريحة جيدا ثم اغمر في صبغة Safranin لمدة 30 إلى 60 ثانية.
• غسل الشريحة ثم جففها
• فحصها
صبغة زيل نلسن :
• تحضير لطخة من البلغم الغليظ ( لاحتمال وجود عصيات السل بكمية اكبر) على شريحة زجاجية مع التثبيت بواسطة اللهب.
• غمر الشريحة بصبغة الكاربول فوكسين مع التسخين حتى يتصاعد البخار و ظهور لون ذهبي ننتظر لمدة 3-4 دقائق.
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي.
• غمر الشريحة في أسيد الكحول لمدة 5 دقائق حتى تصبح اللطخة لونها زهري فاتح ( لإزالة الصبغة من البكتريا).
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي.
• غمر الشريحة بصبغة المثيلين بلو من 2-3 دقائق.
• اغسل الشريحة بماء الحنفية الهادي
• أجففها بواسطة ورق ترشيح
• و من ثم الفحص
ملاحـظـه:
• يستحسن استخدام ماء مقطر في عملية الغسيل حيث توجد أنواع من البكتيريا المقاومة للأحماض في مياه الصنبور
• البعض يستخدم أنية خاصة لصبغ عدد من الأفلام مرة واحدة و هذا خطاء فربما انتقلت البكتيريا المقاومة للأحماض من عينه ايجابية إلى أخرى سلبية فيجب الصبغ كل شريحة على حده
• يجب عمل شريحتين لكل عينة و فحص كل شريحة لمدة 20 – 30 دقيقة لأنه إذا وجد في الفلم كله عدد 1 عصية سل يدل على أن الميكروب يوجد بنسبة 000, 10 مكبرة لكل 1سنتيمتر مكعب في عينة البلغم
فحص البيئات و التعرف على المستعمرات
• وصف المستعمرة:
الحجم – الشكل – شفافة أو معتمة – جافه أو مخاطية – مسطحة أو مرتفعة – ذات حافة محددة أو مشرشرة
اللون حيث أن هناك نوعين فبعضها تعطي صبغة داخلية مثل المكورات العنقودية الذهبية و مستعمرة تعطي صبغة خارجية تنتشر في البيئة مثل عصيات الصديد الأزرق.
• التحلل الدموي في أطباق أجار الدم:
حيث هذه الخاصية تقسم المكونات السبحية إلى ثلاث أنواع:
- مكورات سبحية بيتا ------ تحلل كلي حول المستعمرة
- مكورات سبحية آلفا ------ تحلل جزئي حول المستعمرة
- مكورات سبحية جاما ----- لا تحلل الدم.
• مخمرة للاكتوز أو غير مخمرة:
في أطباق ماكونكي أجار:
حيث المخمرة تعطي اللون الوردي و الغير مخمره تعطي اللون الأصفر
في أطباق كليد أجار:
حيث المخمرة تعطي اللون الأخضر و الغير مخمرة تعطي اللون الأصفر
• أنواع البيئات المنماة عليها:
حيث أن كل ميكروب يفضل بيئة معينة لتنمو فيها و البعض لا ينمو في بيئات أخرى في وقت أنها مناسبة للميكروبات أخرى.
و بالتالي تعتبر خاصية للتفرقة بين أنواع الميكروب.
الاختبارات البيوكيميائية
1- اختبار الأكسيديز (ورقة ترشيح):
عندما تكون البكتيريا سالبة للاكتوز نقوم بهذا الاختبار
فإذا كانت النتيجة موجبة فالبكتيريا سيدومونص
و إذا سالبة فنعمل API
إذا اختبار الأكسيديز هو للتفرقة بين سيدومونص و البكتيريا الأخرى
2- اختبار الكتاليز (الشريحة والغاز):
عندما تكون البكتيريا موجبة اللاكتوز نقوم بهذا الاختبار
فإذا كانت النتيجة موجبة فهي ستاف و نتجة لعمل Dnase
و إذا سالبة فهي ستربتو و نعمل اختبار المجموعة
* هنا في هذا الاختبار لا يتم عمله إلا إذا حصل تحلل (ستناف, ستربتو)
3- اختبار nase :
هو اختبار يكون على بيئة Dnase و هي للتفرقة بين الستاف و الستربتو حيث يتم بإضافة HCL
4- اختبار API:
و بعد ذلك نقوم بعمل أقراص الحساسية حسب البكتيريا المكتشفة عندنا
اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية
هذه الاختبارات و ذلك بالزرع على Mueller Hinton agar و ذلك عن طريق الزرع بواسطة البكتيريا الممرضة المنماة مسبقا. بحيث نأخذ من طبق البكتيريا مستعمرة واحدة نقية و يتم زراعتها على طبق Mueller Hinton agar
و يوضع عليها أقراص الحساسية الخاصة بكل نوع من الجراثيم و تحضن لمدة 24 ساعة.
يستخدم blood agar بدلا من Mueller Hinton agar في حالة:
المركسبلا
المكورات السبحية بأنواعها
يستخدم Chocolate Agar في حالة:
النيسيريا
عصيات الأنفلونزا
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم مع المكورات العنقودية والسبحية :
بنسلين - اوكساسلين- إثروميسين - كيفالوسين - كوتركساسلين - كلينداميسين تيتراسيكلين -امبسلين- اجمنتين
- سيفوكسين- سيفوتاكسيم- جاراميسين- توبراميسين.
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم للعصيات السلبية جرام:
امبسلين- اجمنتين – سيفوكسين – سيفوتاكسيم – جاراميسين – توبراميسين كيفالوسين – كوترموكساسلين – اميكسين – امبينم – اذترونم – ببراسلين – كبروفلوجزاسلين – كلورامفينكول – تيتراسيكلين – سيفتازيديم.
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم في عصيات الصديد الأزرق:
اميكاسين – كاربنسلين ببراسلين – نتلميسين – توبراميسين – جنتاميسين – سيفتازيديم – سفترياكسون.
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم مع الميكروبات المفصولة من البول:
نالدكسك أسد – نيتروفيورانتوين – نورفلوجساسين – ميثلينم – امبسلين – جنتاميسين – كيفالوسين – كوترموكساسلين.
تسجل النتائج كالتالي :
حساسة S ) Sensitive )
متوسطة الحساسية I ) Intermediate )
مقاومة R ) Resistant )
و تسبب المرض للحيوان و الإنسان و الطيور و النباتات و الحشرات و لها دور كبير في أحداث الأمراض الوبائية التي تصيب الصغار و الكبار و تلوث الغذاء و الهواء و مياه الشرب .
فإنه نظرا لما يتطلبه هذا القسم الذي بدأ المستشفى يعتمد عليه في التشخيص المخبري لدى المريض لذا واجب القيام بعمل هذه النبذة المختصرة بقسم الميكروبيولوجي.
حيث يسعدني أن اقدم لكم هذا الكتاب المرشد للعامل في قسم الميكروبيولوجي.
فهو كتاب منهجي علمي مبسط تم أعداده من قبل أطباء مختصصين في الميكروبيولوجي بحيث يستطيع أن يستوعبه كل من يطلع عليه في سهولة و يسر .
يلزم العمل بقسم الميكروبيولوجي الدقة التامة في الأداء و الحرص على نظافة المعمل قبل و بعد العمل حيث أننا نتعامل مع الجراثيم الحية ، في معظم الأحوال تكون ضارة و معدية مسببة أمراض خطيرة.
التعليمات التالية:
1-أن يكون العمل مرتبا بحيث تكون الأدوات و المحاليل في أماكنها المستخدمة
2-يجب أن تكون الأدوات نظيفة و معقمة تعقيما تاما حتى لا تكون عرضة للتلوث بحالات مرضية.
3-المحافظة على الأحواض و البنش من تلوثها بالصبغات
4-يراعى إلقاء العينات بعد انتهاء العمل منها و الأدوات المستعملة في أماكنها المخصصة
5-عند العمل في العمل في الميكروبيولوجي يراعى أولا لبس القفازات و الكمامة و كذلك توضع ورقة ترشيح أمامك على البنش لكي لا تسقط أي جزء من العينة على البنش فيولوثه
6-توضع العينة و الإبرة في الحامل الخاص بها
7-يراعى نظافة مكان العمل بعد الانتهاء من العمل مباشرة
8-يراعى غسل ألا يدي بالماء و الصابون و المطهر بعد الانتهاء من العمل مباشرة
9- يرعى عدم الأكل و الشرب و التدخين أو وضع ألايدي في الفم و العين أثناء العمل
10- حرق و إعدام المزارع و العينات بعد الانتهاء منها في فرن الحرق
طرق جمع العينات :
لتشخيص الميكروب المسبب للمرض و فصله في حالة نقية يجب اخذ العينة من مكان الإصابة في جسم الإنسان أو الحيوان أو أي سائل محتمل وجود جراثيم مرضية به.
تعليمات مهمة لجمع العينات:
• يستحن أن تؤخذ العينة من المريض قبل بدء العلاج بالمضادات و ذلك لأنها تؤدي إلى عدم نمو الميكروبات على البيئات و بذلك تعطي نتائج غير صحيحة
• تؤخذ عينات البلغم للكشف عن الدرن في الصباح و كذلك عينات البول و تكون من الوسط و هذا هو الأفضل
• عند اخذ مسحات من الحلق يراعى أن يكون الحلق قد مس بأي مطهر أو غرغرة قبل اخذ العينة
• أن تكون العينة المراد زراعتها في كونتينر خاص و معقم
• أن يرفق بالعينة الركوست الخاص بها و مبين فيه الأتي:
1. اسم المريض
2. رقم ملف المريض
3. عمر المريض و جنسه
4. قسم المريض
5. نوع العينة
6. نوع الفحص المطلوب
7. عما إذا كان المريض يأخذ مضادات حيوية و نوعها
8. و كذلك نبذة عن تشخيص المريض
9. اسم الطبيب المعالج و ختمه
• توضع في أوعيه أو حاويات معقمة و جافة و يجب أن تكون محكمة الإغلاق
• تأكد من أن المعلومات مسجلة على العينة
• وضع رقم تسلسلي خاص بقسم الميكروبيولوجي
• التأكد من أن السوائل لا تتسرب من الأنبوب حتى نتفادى الأخطار حتى لا تنتقل العدوى
• التعامل مع العينات في كابينة خاصة حتى لا تؤدي إلى انتشار العدوى
العينات التي يجب رفضها و عدم استقبالها :
1-عينه ليس عليها البيانات الكافية من اسم المريض و التاريخ و نوع العينة و خلافه ...
2-عينة بدون ركوست
3-عينه بها تسرب
4-عينة تأخرت أكثر من 12 ساعة
5-عينه في حاوية غير نظيفة و ليست بالمواصفات المطلوبة
6-عينة بلغم و ليست ببلغم ولكنها لعاب فقط
البيئات culture media :
هي الوسط الصناعي الذي تنمو و تتكاثر عليه البكتريا لأنه يحتوي على المواد الغذائية اللازمة للميكروب و التفاعل الهيدروجيني المناسب له و أيضأ يحتوي على الأكسجين أو ثاني أكسيد الكربون و يحتوي أيضا على الأحماض الأمينيه و الأملاح المعدنية و كل ميكروب ينو و يتكاثر على مستنبت خاص به حيث يحتوي على متطلباته
مثل:
1-Blood Agar
2-Maconkey Agar
3-Chocolate agar
4-Cled Agar
5-Salmonella Shigella Agar (S.S.A).
6-Maconkey Agar. MA.
7-XLD Agar.
ملاحظات هامة عند الزرع
• يلاحظ عند اخذ العينة باللوب التأكد من ملء دائرة اللوب بالعينة و إخراجها من الأنبوبة باحتراس حيث لا تلمس جدار الأنبوبة.
• عند الزرع على الطبق يراعى عدم الضغط على البيئة مما يؤدي إلى تجريح سطح البيئة
• يلاحظ فتح الطبق بمقدار معين و غلقة بعد وضع المزرعة بسرعة حتى لا تتعرض للتلوث
• إبعاد الطبق عن التنفس أثناء الزرع لعدم تلوث الطبق بالبكتيريا الموجودة في زفير الشخص الذي يعمل في المزرعة
• وضع الطبق في الحاضنة بحيث يكون الغطاء للأسفل
• يتم قراءة الأطباق في اليوم التالي و تتم القراءة أولا بعدد المستعمرات (colony count)
ثم تصنف كالأتي :
• إذا لاحظت نمو أكثر من نوعين من المستعمرات على نفس الطبق فان ذلك يعني تلوث و يتوجب طلب عينه أخرى و يتم زرعها
• إذا كان عدد المستعمرات اقل من 10 مستعمرات فإن ذلك يهمل و يعتبر غير ذو قيمة و ليس له أهمية No significant growth
• إذا كان عدد المستعمرات من 10-19 مستعمرة فإنه يعتبر مشكوك فيه و يتم عمل حساسية له و تكتب النتيجة النهائية له.
• إذا كان عدد المستعمرات أكثر من20 فإن ذلك يعتبر نمو حقيقي و يتم عمل اختبارات الحساسية له
عينات البولURINE :
البكتيريا المحتمل وجودها في عينة البول:
• المكورات العنقودية الذهبية staph.aureus
• المكورات السبحية البراز ية
• عصيات الحميات المعوية (التيفود)
• عصيات القولون E.coli ,Strept. faecalis
• عصيات البروتيص
• السيلان
• السل
البيئات المستخدمة في عينات البول:
Blood agar:
بعض أنواع البيئات لا تنمو ألا بوجود الدم مثل:
الالتهاب السحائي الوبائي _الالتهاب الرئوي.
بعض أنواع البكتيريا تفرز خمائر تذيب كرات الدم الحمراء فيمكن التعرف عليها مثل الأنواع المختلفة من المكورات السبحية.
و أهميتها في تمييز نوع التحلل ألفا, بيتا, جاما
Chocolate agar:يستخدم في مزارع الالتهاب الرئوي-السيلان-الأنفلونزا
و أهميتها أيضا في تمييز نمو بكتيريا نيسيريا, هيموفلص
: MacConkeys medium
و هو للتعرف على البكتريا المخمرة لسكر اللاكتوز ( لون احمر أو وردي ) و التي لاتخمرة (نفس لون البيئة) و تنمو فيها عائلة البكتيريا المعوية
: Cled agar
للتفريق بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز و التي لا تخمرة و تحد من نمو بكتيريا البروتيص
طريقة أخذ العينة:
• أن تكون العينة من وسط البول و ذلك حتى لا تحتوي على إفرازات من مجرى البول.
• أن يراعى التنبيه على المريض و خصوصا السيدات بغسل الأعضاء التناسلية الخارجية جيدا بالماء و الصابون.
• يجب أن تفحص العينة خلال 3 ساعات من جمعها حيث أن تكاثر و نمو البكتيريا مما يودي إلى خلل في النتائج الكيميائية مثل نقص الجلوكوز و خلافه.
طريقة الزرع:
1) يتم تسجيل العينة و وضع البيانات في الملف الخاص بالزرع.
2) يتم تسجيل رقم العينة الخاص بالمختبر على الطبق
3) يتم خلط العينة بهدوء لتوزيع أي راسب يكون في قاع العينة.
4) يتم الزرع بأخذ نقطة أو نقطتين من البول و يتم وضعها داخل طبق الزرع
5) يتم توزيع نقطة البول في الطبق باستخدام الإبرة حسب ميكانيكية معينة.
6) توضع الأطباق في الحاضنة عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
عينات البراز :
البكتيريا المحتمل و جودها في عينة البراز:
• السالمونيلا و الشيجيلا
• الكوليرا
• المكورات العنقودية الذهبية staph.aureus
• الإيشريشيا كولاي
• البروتيص
البيئات المستخدمة في على وجه العموم فهي كما يلي:
S.S agar :
تستخدم للعينات البرازية و هي بيئة انتخابية حيث أن هذه البيئة تثبط نمو البكتيريا الموجبة للجرام و كذلك تحتوي
على مثبطات نمو البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز.
فبنسبة للسالونيلا في XLD فلونها زهري و المركز توجد نقطة سوداء
أما في الشيجيلا فلونها زهري و بدون مركز اسود اللون السائد زهري
EMB :
بيئة تفريقية لعزل البكتيريا المعوية السالبة للجرام مثل: سالمونيلا, بروتيص, شيجيلا حيث تحتوي هذه البيئة على دليلين هما Eosine وMethylene blue الذين يفرقان بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز و غير المخمرة
DCA :
تحوي سكر اللاكتوز لذلك تفرق بين المخمرة و غير المخمرة لونها احمر فاتح يقترب من البني في حالة التخمر يتحول لونها إلى الأحمر الباهت.
حيث السالمونيلا لا لون لها و في المركز نقطة سوداء
أما الشيجيلا فهي بدون لون
S.B) Selenite broth
و هي بيئة سائلة غنية لنمو السالمونيلا بأنواعها :
المســحـــات SWABS
البيئات المستخدمة في عينة المسحة:
Blood Agar*
*Sabouraud Agar
Macconkey Agar*
* Chocolate Agar
أما البكتيريا المتوقع نموها فهي كالتالي و ذلك حسب المنطقة المعزولة منها:
1-Beta.Hameolytic Streptococci.
2-Corynebacterium Diphtheriae.
3-Bordetella Pertussis.
4-Meningococci.
5-Staph Aureus.
6-Haemophills Influenzae.
7-Candida albicans.
أنواع المسحات:
1) مسحة من الزور أو الحلق في حالة الدفتيريا – التهاب الزور تزرع على B.A لاحتمال وجود المكورات السبحية المذيبة للدم أو العنقودية الذهبي تزرع على MAC عينات سلبية للجرام
2) مسحة من الجروح و الدمامل و الناسور
3) مسحة من الشرج في الأطفال في حالة الدوسنتريا
4) مسحة من الشرج في حالات الوفاة كما في الكوليرا
5) مسحة من التقيحات التي بالأذن، الأنف، العيون
تزرع على BA لا هوائي و هوائي و أيضا MAC
6) مسحة من الرحم كما في حالة السيلان- حمى النفاس
تزرع على BA+CO2 لاحتمال وجود مكورات سبحية مذيبة للدم
تزرع على MAC لاحتمال وجود العصيات سلبية جرام (بكتيريا القولون)
البيئات المستخدمة في عينة المسحة:
نستعمل Blood Agar و Macconkey Agar فقط
أما في حالة مسحة من الرحم أو العين فنستعمل Blood Agar و Chocolate Agar
التعرف على البكتيريا :
الفحص الميكروسكوبي عن طريق صبغ العينة:
أهمية الصبغة:
1. رؤية البكتيريا و التعرف عليها.
2. بعض أنواع الصبغات تستخدم في التفرقة بين أنواع البكتيريا مثل صبغة جرام التي تفرق بين الإيجابية و السلبية
و صبغة زيل نلسن تصبغ البكتيريا المقاومة للأحماض.
أنواع الصبغات:
**صبغات بسيطة :
• methylene blue stain
• صبغة كاربول فوكسين
**صبغات مركبة :
و هي الصبغات التي تستخدم فيها أكثر من صبغة أولية و منها
• صبغة جرام
و هي تتكون من صبغة الميثيل فيولت Methyl violet و كذلك صبغة اليود Lugol's iodine
• صبغة الزيل نلسن:
تستخدم هذه الصبغة لصبغ البكتيريا المقاومة للأحماض (Acid –Fast) مثل الميكوبكتيريا و ذلك لاحتواء هذه البكتيريا على مواد شمعية لذلك يلزم استخدام مثل هذه الصبغة مع التسخين.
و سوف نتحدث عن صبغة جرام و صبغة الزيل نلسن بشي من التفصيل
صبغة جرام :
• تحضير اللطخة البكتيرية باستخدام محلول ملحي
• غمر الشريحة بمحلول Crystal violet لمدة 30الى 60 ثانية
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي
• غمر الشريحة بمحلول اليود لمدة 30الى 60 ثانية
• غسل الشريحة ثم اغمر في الكحول المطلق لمدة 60 ثانية
• غسل الشريحة جيدا ثم اغمر في صبغة Safranin لمدة 30 إلى 60 ثانية.
• غسل الشريحة ثم جففها
• فحصها
صبغة زيل نلسن :
• تحضير لطخة من البلغم الغليظ ( لاحتمال وجود عصيات السل بكمية اكبر) على شريحة زجاجية مع التثبيت بواسطة اللهب.
• غمر الشريحة بصبغة الكاربول فوكسين مع التسخين حتى يتصاعد البخار و ظهور لون ذهبي ننتظر لمدة 3-4 دقائق.
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي.
• غمر الشريحة في أسيد الكحول لمدة 5 دقائق حتى تصبح اللطخة لونها زهري فاتح ( لإزالة الصبغة من البكتريا).
• غسل الشريحة بماء الحنفية الهادي.
• غمر الشريحة بصبغة المثيلين بلو من 2-3 دقائق.
• اغسل الشريحة بماء الحنفية الهادي
• أجففها بواسطة ورق ترشيح
• و من ثم الفحص
ملاحـظـه:
• يستحسن استخدام ماء مقطر في عملية الغسيل حيث توجد أنواع من البكتيريا المقاومة للأحماض في مياه الصنبور
• البعض يستخدم أنية خاصة لصبغ عدد من الأفلام مرة واحدة و هذا خطاء فربما انتقلت البكتيريا المقاومة للأحماض من عينه ايجابية إلى أخرى سلبية فيجب الصبغ كل شريحة على حده
• يجب عمل شريحتين لكل عينة و فحص كل شريحة لمدة 20 – 30 دقيقة لأنه إذا وجد في الفلم كله عدد 1 عصية سل يدل على أن الميكروب يوجد بنسبة 000, 10 مكبرة لكل 1سنتيمتر مكعب في عينة البلغم
فحص البيئات و التعرف على المستعمرات
• وصف المستعمرة:
الحجم – الشكل – شفافة أو معتمة – جافه أو مخاطية – مسطحة أو مرتفعة – ذات حافة محددة أو مشرشرة
اللون حيث أن هناك نوعين فبعضها تعطي صبغة داخلية مثل المكورات العنقودية الذهبية و مستعمرة تعطي صبغة خارجية تنتشر في البيئة مثل عصيات الصديد الأزرق.
• التحلل الدموي في أطباق أجار الدم:
حيث هذه الخاصية تقسم المكونات السبحية إلى ثلاث أنواع:
- مكورات سبحية بيتا ------ تحلل كلي حول المستعمرة
- مكورات سبحية آلفا ------ تحلل جزئي حول المستعمرة
- مكورات سبحية جاما ----- لا تحلل الدم.
• مخمرة للاكتوز أو غير مخمرة:
في أطباق ماكونكي أجار:
حيث المخمرة تعطي اللون الوردي و الغير مخمره تعطي اللون الأصفر
في أطباق كليد أجار:
حيث المخمرة تعطي اللون الأخضر و الغير مخمرة تعطي اللون الأصفر
• أنواع البيئات المنماة عليها:
حيث أن كل ميكروب يفضل بيئة معينة لتنمو فيها و البعض لا ينمو في بيئات أخرى في وقت أنها مناسبة للميكروبات أخرى.
و بالتالي تعتبر خاصية للتفرقة بين أنواع الميكروب.
الاختبارات البيوكيميائية
1- اختبار الأكسيديز (ورقة ترشيح):
عندما تكون البكتيريا سالبة للاكتوز نقوم بهذا الاختبار
فإذا كانت النتيجة موجبة فالبكتيريا سيدومونص
و إذا سالبة فنعمل API
إذا اختبار الأكسيديز هو للتفرقة بين سيدومونص و البكتيريا الأخرى
2- اختبار الكتاليز (الشريحة والغاز):
عندما تكون البكتيريا موجبة اللاكتوز نقوم بهذا الاختبار
فإذا كانت النتيجة موجبة فهي ستاف و نتجة لعمل Dnase
و إذا سالبة فهي ستربتو و نعمل اختبار المجموعة
* هنا في هذا الاختبار لا يتم عمله إلا إذا حصل تحلل (ستناف, ستربتو)
3- اختبار nase :
هو اختبار يكون على بيئة Dnase و هي للتفرقة بين الستاف و الستربتو حيث يتم بإضافة HCL
4- اختبار API:
و بعد ذلك نقوم بعمل أقراص الحساسية حسب البكتيريا المكتشفة عندنا
اختبارات الحساسية للمضادات الحيوية
هذه الاختبارات و ذلك بالزرع على Mueller Hinton agar و ذلك عن طريق الزرع بواسطة البكتيريا الممرضة المنماة مسبقا. بحيث نأخذ من طبق البكتيريا مستعمرة واحدة نقية و يتم زراعتها على طبق Mueller Hinton agar
و يوضع عليها أقراص الحساسية الخاصة بكل نوع من الجراثيم و تحضن لمدة 24 ساعة.
يستخدم blood agar بدلا من Mueller Hinton agar في حالة:
المركسبلا
المكورات السبحية بأنواعها
يستخدم Chocolate Agar في حالة:
النيسيريا
عصيات الأنفلونزا
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم مع المكورات العنقودية والسبحية :
بنسلين - اوكساسلين- إثروميسين - كيفالوسين - كوتركساسلين - كلينداميسين تيتراسيكلين -امبسلين- اجمنتين
- سيفوكسين- سيفوتاكسيم- جاراميسين- توبراميسين.
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم للعصيات السلبية جرام:
امبسلين- اجمنتين – سيفوكسين – سيفوتاكسيم – جاراميسين – توبراميسين كيفالوسين – كوترموكساسلين – اميكسين – امبينم – اذترونم – ببراسلين – كبروفلوجزاسلين – كلورامفينكول – تيتراسيكلين – سيفتازيديم.
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم في عصيات الصديد الأزرق:
اميكاسين – كاربنسلين ببراسلين – نتلميسين – توبراميسين – جنتاميسين – سيفتازيديم – سفترياكسون.
مجموعة المضادات الحيوية التي تستخدم مع الميكروبات المفصولة من البول:
نالدكسك أسد – نيتروفيورانتوين – نورفلوجساسين – ميثلينم – امبسلين – جنتاميسين – كيفالوسين – كوترموكساسلين.
تسجل النتائج كالتالي :
حساسة S ) Sensitive )
متوسطة الحساسية I ) Intermediate )
مقاومة R ) Resistant )
